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Durch Ablösen einzelner Untereinheiten mit Hilfe des Detergens Lauryldimethyloxid (LDAO) konnten aus der V1ATPase (A3:B3:C:D:E:F:G2:Hy) aus Manduca sexta hydrolytisch aktive Subkomplexe gewonnen werden. Diese waren A3B3DEG (176% Hydrolyseaktivität relativ zur V1ATPase), A3B3HEGF (53 %), A3B3EG (58 %) und A3B3DEGH (47 %). Der zur Hydrolyse minimal notwendige A3B3EG-Subkomplex wurde hinsichtlich der Lage der Stieluntereinheiten E und G elektronenmikroskopisch untersucht. Die Bildanalyse der mit Uranylacetat negativ kontrastierten A3B3EG-Moleküle zeigte die sechs hexagonal und alternierend angeordneten Untereinheiten A und B. Im Zentrum des Hexamers befand sich die Untereinheit E mit G. Der A3B3EG-Subkomplex wurde auch im Verhalten beim zeitaufgelösten proteolytischen Verdau mit der vollständigen V1ATPase aus M. sexta und der Untereinheit E aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae verglichen. Während die ungeschützte Untereinheit E aus S. cerevisiae innerhalb weniger Minuten gespalten wurde, verzögerte der partielle Schutz durch die katalytischen Untereinheiten A und B im A3B3EG-Subkomplex die Spaltung der Untereinheit E durch Trypsin. In der kompletten V1ATPase war die Untereinheit E durch die Stieluntereinheiten C, D, F, G und H von der Proteolyse abgeschirmt, so dass die Spaltung noch weiter protrahiert wurde. Der zur Topologiebestimmung genutzte Nulllängenvernetzer CuCl2 führte zu den Vernetzungsprodukten A-B-E, A-B-D-E und D-E. Die Kreuzvernetzung mit dem photoaktivierbaren Nukleotidanalogon P1,P4-Di-(3’-Biotinyl-8-azidoadenosin-5’-)-tetraphosphat (8-DiN3-DiB-AP4A) ergab die Produkte E-G, A-F(-G), A-B-E-G und D-E. Das mit beiden Kreuzvernetzern auftretende Produkt aus dem zentralen Kopplungselement E und der Stieluntereinheit D zeigte ihre räumliche Nähe zueinander. Bei der fluoreszenzspektroskopischen Untersuchung der an die katalytische Untereinheit A der V1ATPase gebundenen Fluoreszenzsonde N-[4-[7-(dimethylamino)-4-methyl]-cumarin-3-yl)]-maleimid (CM, Cumarinmaleimid) änderte sich die Sondenumgebung durch die Bindung von MgATP und MgADP bei einer Abnahme der Intensität um 20% (ATP) bzw. 25% (ADP) hin zum hydrophileren Milieu. Die Bindung von MgAMP-PNP und MgADP+Pi bewirkte keine Verschiebung des Fluoreszenzmaximums, die Intensität der Emission erhöhte sich um 10% (ADP+Pi) bzw. 25% (AMP-PNP). Die Untersuchung der intrinsischen Fluoreszenz des in den Untereinheiten A, B, C und H enthaltenen Tryptophans ergab in Abhängigkeit von der Bindung eines Nukleotids eine Abnahme der Fluoreszenzintensität um 50% in Anwesenheit von MgADP+Pi bzw. 65% (MgADP) und 72% (MgATP). In Anwesenheit des nicht hydrolysierbaren Nukleotidanalogons MgAMP-PNP war die Abnahme um 77% am stärksten. Dabei fand keine durch Verschiebung der Emissionsmaxima messbare Änderung der Umgebung der Tryptophane statt. Die Fluoreszenzspektroskopie verdeutlichte die Kopplung von der Nukleotidbindung am A3B3-"Köpfchen" der V1ATPase über die Stieluntereinheiten zum membrangebundenen VO-Teil bis zu dem daraus resultierenden Transport von Ionen über die Membran.
By detachment of single subunits of V1ATPase (A3:B3:C:D:E:F:G2:Hy) from Manduca Sexta with the detergent Lauryldimethyloxide (LDAO) hydrolytical active subcomplexes could be won. These were A3B3DEG, A3B3HEGF, A3B3EG and A3B3DEGH with a hydrolytic activity of 176 %, 53 %, 58% and 47% relative to the V1ATPase, respectively. The A3B3EG-subcomplex, which was minimum necessary for hydrolysis, was examined through electron microscopy in regard to the location of the stalkforming subunits E and G. Image analysis of the uranyl-acetate negative stained A3B3EG-molecule showed six hexagonal and alternating arranged subunits A and B. In the center of the hexamere subunits E and G were located. The A3B3EG-subcomplex was also compared in its behavior of limited tryptic digestion to the complete V1ATPase from M. sexta and subunit E from the yeast Saccharomyces cerevisiae. While the unprotected subunit E from S. cerevisiae was digested within few minutes, the partial protection by the catalytic subunits A and B delayed cleaving of the subunit E in the A3B3EG-subcomplex. Subunit E was shielded by the stalk-subunits C, D, F, G and H against proteolysis in the complete V1ATPase, so digestion was further prolongated. In order to identify the topology of the V1ATPase the zero-length crosslinker CuCl2 was used, resulting in the cross-linking formations A-B-E, A-B-D-E and D-E. Crosslinking with the photoaffinity label and nucleotide analogue P1,P4-Di-(3’-Biotinyl-8-azidoadenosine-5’-)-tetraphosphate (8-DiN3-DiB-AP4A) caused the products E-G, A-F(-G), A-B-E-G and D-E. The product of the central coupling element E and the stalk subunit D, which appeared with both crosslinkers, showed their proximity to each other. During the fluorescence-spectroscopic investigation of the fluorescence probe N-[4-[7-(dimethylamino)-4-methyl]-coumarine-3-yl)]-maleimide (CM, Coumarinmaleimide), which was bound to the catalytic subunit A of the V1ATPase, the probe neighborhood changed by the addition of MgATP and MgADP with a reduction of the intensity of approx. 20% (ATP) resp. 25% (ADP) to a more hydrophilic environment. Binding of MgAMP-PNP and MgADP+Pi did not cause any shift of the fluorescence maximum, the intensity of the emission increased by 10% (ADP+Pi) resp. 25% (AMP-PNP). The examination of the intrinsic fluorescence of the tryptophanes contained in the subunits A, B, C and H resulted in a reduction of the fluorescence intensity depending on the binding of a nucleotide at approx. 50% in presence of MgADP+Pi resp. 65% (MgADP) and 72% (MgATP). In presence of the not hydrolyzable nucleotide analogue MgAMP-PNP the decrease was highest with 77%. No changes of the environment of the tryptophanes measurable by shift of the emission maxima took place. Fluorescence spectroscopy showed the coupling of the nucleotide binding site at the A3B3-"headpiece" of the V1ATPase via the stalk subunits to the membrane-bound VO-part with the resulting transport of ions across the membrane.
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